Méthode d'investigation génétique moléculaire

Pour étudier et identifier les variants dans la structure de l'ADN, on utilise une méthode de génétique moléculaire. Pour chaque région d'ADN examinée, la région est un chromosome, un gène ou un allèle, les méthodes sont différentes. Au cœur de chaque méthode moléculaire-génétique, il existe une certaine manipulation de l'ARN et de l'ADN. Toutes ces méthodes sont extrêmement complexes, sans que les conditions de laboratoire ne puissent être menées, et le personnel doit être hautement qualifié. Ce travail se déroule en plusieurs étapes.

Étapes

Tout d'abord, des échantillons d'ARN ou d'ADN doivent être obtenus. Ici, la méthode génétique moléculaire peut être appliquée à presque n'importe quel matériau: une goutte de sang, des leucocytes, une culture de fibroblastes, une muqueuse (raclage), même des ampoules capillaires, – l'ADN peut être obtenu à partir de n'importe quel échantillon. Il est approprié pour appliquer n'importe quelle méthode de génétique moléculaire et leurs diverses variantes, et l'ADN déjà attribué est stocké pendant longtemps dans le gel. La deuxième étape est consacrée à l'accumulation des fragments nécessaires (amplification) de l'ADN, afin de lui permettre d'aider à la réaction de la polymérase en chaîne in vitro (in vitro, sans la participation d'un organisme vivant). En conséquence, le fragment d'ADN sélectionné se multiplie par cette réaction en chaîne, et la quantité d'ADN augmente littéralement un million de fois.

La troisième étape des méthodes génétiques moléculaires d'investigation est la restriction de l'ADN multiplié (c'est la fragmentation, la déchirure ou la coupe). La restriction s'effectue à l'aide d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou d'agarose. Cette méthode génétique moléculaire d'étude de l'ADN permet à chaque fragment d'occuper une certaine position dans le gel. Après cela, le gel est traité avec du bromure d'éthidium, qui peut se lier à l'ADN, l'irradiation ultraviolette est effectuée, après quoi il est possible d'observer les régions de luminescence. Les méthodes génétiques de diagnostic génétique sont diverses et nombreuses, mais les deux premières étapes sont typiques pour tous. Mais pour identifier des fragments d'ADN, le gel peut être coloré avec beaucoup d'autres méthodes existantes.

Variétés

Les méthodes les plus directes et répandues pour détecter les mycobactéries comprennent la méthode de recherche génétique de la génétique moléculaire décrite ci-dessus. L'essentiel est d'identifier dans le matériel de diagnostic des fragments spécifiques de la chaîne des agents pathogènes de l'ADN. Les méthodes génétiques de diagnostic génétique n'ont pas encore un moyen plus efficace de reconnaître une telle maladie que la tuberculose. À l'aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), vous pouvez être sûr que l'ADN original augmentera le nombre de copies en un million de fois, c'est-à-dire qu'il y aura une amplification, ce qui permettra de visualiser les résultats. Le niveau de sensibilité ici est très élevé – plus de quatre-vingt-quinze pour cent, ce qui constitue l'avantage principal de cette méthode.

Le reste des méthodes de recherche génétique moléculaire sont deux fois plus efficaces que les copies en double, car dans ce cas, l'échantillon éditorial montre une séquence oligonucléotidique spécifique augmentée de cent six fois. Même le diagnostic culturel de la tuberculose des organes respiratoires est beaucoup plus faible dans sa sensibilité. C'est pourquoi la médecine moderne est basée sur des méthodes génétiques moléculaires pour diagnostiquer la tuberculose. Et la méthode décrite est particulièrement efficace pour rencontrer des agents pathogènes de grande variabilité antigénique, ce qui est beaucoup plus difficile à déterminer par une autre méthode – des milieux nutritifs spéciaux et une longue période de culture sont nécessaires. Les méthodes biochimiques et génétiques moléculaires donnent des effets complètement différents.

Diagnostic de la tuberculose

Ils construisent le diagnostic PCR de la tuberculose le plus souvent en utilisant ces séquences d'ADN spécifiques pour les quatre types de cette maladie. Pour atteindre cet objectif, les amorces qui détectent des séquences d'éléments IS (IS-986, IS-6110) sont les plus souvent utilisées, car ces éléments migrateurs ne caractérisent que les types de mycobactéries de la tuberculose et sont toujours présents dans plusieurs copies du génome. En outre, l'ADN peut être isolé de cultures pures et cliniques (crachats de patients) par toute autre méthode acceptable. Par exemple, il existe la méthode Boom, qui utilise un tampon de lyse à base de guanidine, de silice et de thiocyanate comme vecteur d'ADN. Le nombre de patients avec une excrétion bactérienne insuffisante augmente d'année en année et, par conséquent, un niveau d'organisation complètement différent s'est établi dans la pratique clinique: la méthode génétique moléculaire d'étude de l'ADN joue un rôle majeur dans le diagnostic.

Cependant, nous devons admettre que ce n'est pas sans failles non plus. L'application de la méthode PCR apporte souvent une énorme quantité de résultats faussement positifs, et la faute ici n'est pas seulement des erreurs techniques, mais aussi les particularités de la méthode elle-même. Entre autres choses, en utilisant cette méthode de diagnostic, il est tout simplement impossible de déterminer le degré de viabilité des mycobactéries détectées. Mais cet inconvénient n'est pas le plus important. Les méthodes génétiques moléculaires de diagnostic par PCR impliquent le risque de contamination de l'ADN mycobactérien. Les exigences de certification pour cette raison pour les laboratoires de PCR sont extrêmement rigides, ils nécessitent la présence de trois chambres isolées. La technologie PCR est moderne et très complexe, son utilisation nécessite un équipement adéquat et un personnel hautement qualifié.

Bacterioscopie

Lors de l'établissement du diagnostic, les résultats de l'étude PCR doivent nécessairement être comparés avec le reste des données: l'examen clinique, la radiographie, la microscopie à frottis, le semis et même la réponse à un traitement spécifique sont très importants ici. Dans cette série d'études, la PCR n'est qu'une des composantes. Détecter l'agent pathogène au tout début du diagnostic peut être la méthode la plus simple et la plus rapide – bactériologique.

Ici, nous utilisons un microscope optique (couleur Tsil-Nielsen) et une luminosité (coloration au fluorochrome). L'avantage de la bactérioscopie est la vitesse avec laquelle les résultats sont obtenus. Un inconvénient de celui-ci est considéré comme les possibilités limitées dues à une faible sensibilité. Cependant, cette méthode est donnée à la recommandation de l'OMS comme la plus économique et basique pour identifier les patients atteints de tuberculose. La détection des mycobactéries par une méthode bactériologique a la signification d'un pronostic, et la libération bactérienne est quantifiée. Les méthodes génétiques moléculaires d'étude de la tuberculose sont beaucoup plus confiant avec cela.

Recherche culturelle

La meilleure détection des mycobactéries est reconnue par les études de culture. Le semis de matériel pathologique est effectué dans les milieux d'oeufs: Mordovsky, Finn II, Levenshtein-Jensen et similaires. Une mesure indicative du développement de la résistance des mycobactéries aux médicaments et des preuves indirectes d'efficacité est la quantité de mycobactéries ou leurs colonies in vitro si une méthode d'examen de culture est utilisée. Pour augmenter le pourcentage d'allocation de mycobactéries, le matériel pathologique est semé pour plusieurs médias.

En satisfaisant les nombreux besoins culturels, l'agent causal est également doté de moyens liquides. Dans le même temps, des systèmes automatisés de comptabilité pour la croissance du type VANTES sont utilisés. Les cultures devraient être incubées jusqu'à sept à huit semaines. À cette époque, le semis avec un manque de croissance peut être considéré comme négatif. Le moyen le plus efficace d'identifier les mycobactéries tuberculose est le test biologique: ils infectent le matériel diagnostique des cobayes, qui sont extrêmement sensibles à la tuberculose.

Quelques chiffres

Le domaine de recherche le plus intéressant, qui a été découvert à travers le diagnostic par PCR, était l'étude de M. tuberculosis, une infection latente. Le concept actuel d'infection par la tuberculose suggère que sur une centaine de personnes qui ont été en contact avec M. tuberculosis, quatre-vingt-dix peuvent être infectées, mais seulement 10 d'entre elles ont une maladie active. Le reste a une immunité antituberculeuse, et donc dans quatre-vingt-dix pour cent des cas, l'infection restera latente. C'était la méthode de la génétique moléculaire qui a permis de détecter ce modèle.

La génétique affirme que cinquante-cinq pour cent de ceux qui ont des cultures pathologiques négatives et quatre-vingt pour cent de ceux infectés par M. tuberculosis, mais avec une maladie non radiographique, ont reçu des réponses PCR positives. C'était la méthode génétique de diagnostic qui a aidé à identifier les patients des groupes à risque en utilisant des études de PCR, et les résultats de leurs analyses (microscopie et cultures) étaient négatifs et l'infection subclinique de M. tuberculosis était présente.

Recherche moderne

Les laboratoires bactériologiques de la Fédération de Russie utilisent une méthode accélérée de concentrations absolues: l'activité nitrate réductase des mycobactéries est testée au moyen du réactif Griss. Les centres antituberculeux utilisent une méthode qui permet de déterminer la résistance aux médicaments. Il s'agit d'une culture en milieu liquide, où le système radiométrique et fluorescent pour l'enregistrement de la croissance des mycobactéries est automatisé. Une telle analyse se fait rapidement – jusqu'à deux semaines.

À l'heure actuelle, de nouvelles méthodes sont en cours de développement: la résistance aux médicaments des mycobactéries est évaluée au niveau du génotype. L'étude des mécanismes moléculaires de la résistance montre la présence de gènes dans les mycobactéries. Ces gènes sont associés à la résistance à certains médicaments. Par exemple, les gènes kasA, inhA, katG sont résistants à l'isoniazide, au rpoB à la rifampicine, à l'ARN 16Sp et à la RpsL à la streptomycine, à l'éthambutol, au gyrA à la fluoroquinolone, etc.

Mutations

Dans les diagnostics modernes, le niveau génétique moléculaire de la méthode de l'ADN a considérablement augmenté et permis de mener des études à grande échelle de mutations dans leur spectre entier. Maintenant, nous savons que les mutations des codons 516, 526 et 531 du gène rpoB sont les plus fréquentes et que la résistance à divers médicaments a été identifiée. Il existe toute une gamme de méthodes pour taper des mycobactéries en utilisant non seulement des méthodes traditionnelles – biochimiques, biologiques et culturelles, mais des méthodes génétiques moléculaires modernes sont également largement utilisées. Déjà, il existe des méthodes de diagnostic adéquates et fiables pour détecter les maladies monogéniques. Ils sont basés sur une recherche ADN dans la région exacte d'un gène particulier. Il s'agit généralement d'un processus complexe, long et coûteux, mais les données fournies par les méthodes d'analyse génétique moléculaire sont beaucoup plus précises et informatives que les données de toutes les autres analyses.

On sait depuis longtemps que l'ADN ne change pas sur toute la vie du corps, qu'il se trouve dans n'importe quelle cellule nucléaire, et cela permet de prendre absolument toutes les cellules du corps pour l'analyse, à tout stade de l'ontogenèse. Un gène endommagé peut être détecté avant l'apparition des premiers symptômes, avant la clinique dépliée de la maladie, et aussi chez les personnes hétérozygotes saines, mais ayant une mutation dans le gène. Les méthodes génétiques moléculaires pour le diagnostic des maladies héréditaires peuvent être identifiées par une approche directe du diagnostic de l'ADN et aussi par l'analyse de la ségrégation de la maladie dans la famille avec des locus d'ADN marqueurs (sites polymorphes) étroitement liés au gène endommagé (c'est-à-dire une approche indirecte du diagnostic de l'ADN). Directe ou indirecte – tout diagnostic d'ADN est basé sur des méthodes qui identifient une zone strictement définie de l'ADN humain.

Méthodes directes

Les méthodes directes de diagnostic de l'ADN sont utilisées dans les cas où le gène-culpable de la maladie héréditaire est connu, et les types de ses mutations sont également connus. Par exemple, les méthodes directes sont appropriées pour une variété de maladies. Il s'agit de la chorée de Huntington (expansion des répétitions CTG), de la phénylcétonurie (R408W), de la fibrose kystique (delF508, mutation majeure) et similaires. Le principal avantage de la méthode directe est une précision de diagnostic de cent pour cent, et il n'est pas nécessaire de faire une analyse d'ADN du reste de la famille. Si une mutation dans le gène correspondant est trouvée, elle vous permet de confirmer avec précision le diagnostic d'hérédité, de déterminer le génotype pour le reste de la famille enfouie.

Un autre avantage du diagnostic direct est la détection de transport hétérozygote de mauvaises mutations chez les parents et les parents des personnes décédées de la maladie. Cela est particulièrement vrai pour les maladies autosomiques récessives. Les inconvénients des méthodes directes sont également disponibles. Pour les appliquer, vous devez connaître exactement la localisation du gène pathologique, la structure exon-intron et le spectre de ses mutations. Toutes les maladies monogéniques n'ont pas reçu cette information aujourd'hui. L'informativité des méthodes directes ne peut pas être considérée comme complète, car le même gène peut avoir un grand nombre de mutations pathologiques, ce qui détermine le développement de maladies héréditaires.

Méthodes indirectes

Les méthodes indirectes dans le diagnostic de l'ADN sont utilisées dans d'autres cas: si le gène endommagé n'est pas identifié, mais n'est localisé que sur le chromosome, ou si le diagnostic direct n'a pas donné de résultats (cela se produit si le gène a une organisation moléculaire complexe ou une longueur considérable s'il y en a beaucoup Mutations pathologiques). Les méthodes indirectes sont utilisées pour analyser la ségrégation des marqueurs polymorphes dans la famille des allèles. Les marqueurs sont dans la même région chromosomique ou sont étroitement liés au locus de la maladie et représentent des deletions ou des insertions, des remplacements de points, des répétitions et leur polymorphisme est dû à des nombres différents dans le bloc d'éléments.

Le plus approprié pour le diagnostic indirect sont les marqueurs polymorphes microsatellites et minisatellites, largement distribués dans le génome humain. Leur valeur est exprimée en haute informativité, si la distance génétique entre les dommages dans le gène et le marqueur n'est pas trop importante. Dans ce dernier cas, la précision de l'évaluation est déterminée dans une large mesure par la fréquence de recombinaison entre le marqueur polymorphe et le dommage. Les méthodes indirectes de diagnostic prévoient également l'étape préliminaire obligatoire de l'étude de la fréquence des allèles des populations analysées chez les porteurs de mutations et de patients, ainsi que la nécessité de déterminer la probabilité de déséquilibre et de recombinaison de l'adhésion des marqueurs et des allèles mutants du gène.

Autres méthodes

De courts segments d'ARN ou d'ADN, ainsi qu'un seul gène ne peuvent être visualisés par un examen microscopique, par conséquent, afin d'identifier les mutations, des méthodes de diagnostic génétique moléculaire sont nécessaires. Le «Projet du Génome Humain» existant, comme d'autres réalisations en génétique moléculaire, a de nombreuses façons élargi la possibilité de diagnostiquer des maladies héréditaires, pré-postnatales et postnatales. Ces méthodes peuvent fournir une détection précoce et faire une prédiction des maladies poly et monogènes, dans lesquelles les débuts se produisent à l'âge adulte. Malheureusement, en termes de capacités techniques, les études de génétique moléculaire vont parfois au-delà du cadre éthique établi en ce qui concerne l'hérédité, surtout lorsque le diagnostic se fait à l'adolescence et à l'enfance.

anomalies chromosomiques structurelles et numériques sont les causes les plus courantes de la maladie et le cancer, et de nombreuses malformations. Des aberrations chromosomiques doivent être identifiés, ce qui est important pour le conseil de famille – pour évaluer les prévisions, ainsi que des risques pour la reproduction dans les grossesses futures. L'analyse des chromosomes est le « gold standard » du diagnostic génétique, mais il est limité. Seules les méthodes d' analyse génétique moléculaire peuvent faire plus, parce qu'il ya des étiquettes fluorescentes à base de la technologie de clonage utilisé capables de leur haute sensibilité pour identifier les changements chromosomiques subtiles qui sont impossibles à détecter classiques cytogénétique. Ces techniques se développent de plus en plus nos capacités de diagnostic, lorsqu'on les examine, les enfants ayant une déficience intellectuelle, un retard mental, avec beaucoup d'autres maladies héréditaires.

résultats

Il est très important pour l'humanité étaient la structure génétique et la fonction de la connaissance, les types de variabilité, la capacité à détecter des maladies héréditaires qui se sont produits dans le cadre du développement de la génétique moléculaire. ses méthodes sont destinées à l'étude de la molécule d'ADN – et quand il est normal, et quand il est endommagé. Préparation de séquences d'acides désoxyribonucléiques de nucleotides (ADN) se prolonge dans les étapes de réception d'échantillons pour identifier des fragments individuels. Isolement de l'ADN génomique à partir de cellules, de restriction (déchirure), l'amplification (clonage), l'électrophorèse des fragments (séparation leur charge électrique et la masse moléculaire par électrophorèse sur gel d'agarose). L'identification de fragments spécifiques situés sur la surface d'une bande discrète.

Ensuite, entrer dans l'acte filtres spéciaux, à travers laquelle passe chaque fragment hybridation avec des fragments d'ADN clonés ou de sondes radioactives de synthèse est une commande qui sera égal à l'échantillon d'essai. Si vous changez la position ou la longueur par rapport à la sonde, si un nouveau fragment ou disparu – tout cela suggère que le gène analysé a subi une restructuration dans la séquence nucléotidique. Il y a huit techniques de base des études de génétique moléculaire: séquençage (Détermination de la séquence d'ADN), la réaction en chaîne par polymerase (augmentation du nombre de séquences), la préparation d'amorces gènes connus, le clonage de l'ADN, la production de molécules recombinantes dérivées des protéines dues à des molécules recombinantes, créant ainsi un ensemble complet (collection bibliothèque) fragments clones qui ont été obtenus à l'aide de restriction.