Méthodes biologiques moléculaires de recherche et leur utilisation

Les méthodes de recherche biologique moléculaire jouent un rôle important dans la médecine moderne, la criminalistique et la biologie. Grâce aux progrès dans le domaine des études sur l'ADN et l'ARN, une personne peut étudier le génome de l'organisme, identifier l'agent causal de la maladie, reconnaître l'acide nucléique souhaité dans un mélange d'acides, etc.

Méthodes de recherche moléculaire-biologique. Qu'est-ce que c'est?

Dans les années 70 et 80, les scientifiques ont pu déchiffrer le génome humain pour la première fois . Cet événement a donné une impulsion au développement du génie génétique et de la biologie moléculaire. L'étude des propriétés de l'ADN et de l'ARN a conduit au fait qu'il est maintenant possible d'utiliser ces acides nucléiques pour diagnostiquer la maladie, étudier les gènes.

Préparation de l'ADN et de l'ARN

Les méthodes de diagnostic biologiques moléculaires nécessitent la présence du matériau de départ: plus souvent, ce sont des acides nucléiques. Il existe plusieurs façons d'isoler ces substances des cellules des organismes vivants. Chacun d'entre eux présente ses avantages et ses inconvénients, ce qui doit être pris en compte lors du choix de la méthode d'isolement des acides nucléiques sous forme pure.

1. Préparation de l'ADN selon Marmur. La méthode consiste à traiter le mélange de substances avec de l'alcool, en conséquence de quoi l'ADN pur précipite. L'inconvénient de cette méthode est l'utilisation de substances agressives: le phénol et le chloroforme.

2. Isolation de l'ADN selon Boom. La substance de base utilisée ici est le thiocyanate de guanidine (GuSCN). Il favorise la précipitation de l'acide désoxyribonucléique sur des substrats spécialisés, d'où il peut ensuite être collecté avec un tampon spécial. Cependant, GuSCN est un inhibiteur de PTC, et même une petite partie de celui-ci, piégé dans l'ADN précipité, peut affecter le cours de la réaction en chaîne de la polymérase, ce qui joue un rôle important dans le travail avec les acides nucléiques.

3. Précipitation des impuretés. La méthode diffère des précédentes en ce que les molécules de l'acide désoxyribonucléique elles-mêmes sont précipitées, mais des impuretés. Pour ce faire, utilisez des échangeurs d'ions. L'inconvénient est que toutes les substances ne peuvent pas précipiter.

4. Dépistage de masse. Cette méthode est utilisée dans les cas où des informations précises sur la composition de la molécule d'ADN ne sont pas nécessaires, mais il est nécessaire d'obtenir des données statistiques. Cela s'explique par le fait que la structure de l'acide nucléique peut être endommagée par un traitement avec des détergents, notamment avec des alcalis.

Classification des méthodes de recherche

Toutes les méthodes de recherche biologique moléculaire sont divisées en trois grands groupes:

1. Amplification (à l'aide d'une variété d'enzymes). Ceci inclut la réaction en chaîne PCR-polymerase, qui joue un rôle important dans de nombreuses méthodes de diagnostic.

2. Non-appellation. Ce groupe de méthodes est directement lié au travail des mélanges d'acides nucléiques. Les exemples sont 3 types de tache, d'hybridation in situ, etc.

3. Méthodes basées sur la reconnaissance d'un signal provenant d'une molécule de sonde qui se lie à une sonde spécifique d'ADN ou d'ARN. Un exemple est un système d'hybridation dans une solution Hybride Capture System (hc2).

Enzymes utilisables dans les méthodes de biologie moléculaire

De nombreuses méthodes de diagnostic moléculaire impliquent l'utilisation d'une large gamme d'enzymes. Voici les plus couramment utilisés:

1. Restrictase – "coupe" la molécule d'ADN dans les parties nécessaires.

2. ADN polymerase – synthétise une molécule bicaténaire d'acide désoxyribonucléique.

3. Reverse transcriptase (revertase) – utilisé pour synthétiser l'ADN sur la matrice d'ARN.

4. ADN ligase – responsable de la formation de liaisons phosphodiester entre les nucléotides.

5. L'exonucléase: élimine les nucléotides des sections finales de la molécule d'acide désoxyribonucléique.

La PCR est la principale façon d'amplifier l'ADN

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est activement utilisée dans la biologie moléculaire moderne. Il s'agit d'une méthode dans laquelle un grand nombre de copies peuvent être obtenues à partir d'une seule molécule d'ADN (amplifier des molécules).

Les principales fonctions de la PCR sont:

– Diagnostic des maladies;

Clonage de l'ADN, des gènes.

La réaction en chaîne de la polymérase nécessite les éléments suivants: la molécule d'ADN originale, l'ADN polymérase thermostable (Taq ou Pfu), les phosphates de désoxyribonucléotides (sources de bases azotées), les amorces (2 amorces par molécule d'ADN) et le système tampon lui-même, dans lequel il est possible de réaliser De toutes les réactions.

La PCR se compose de trois étapes: la dénaturation, le recuit des amorces et l'allongement.

1. Dénaturation. À une température de 94 à 95 degrés Celsius, la rupture des liaisons hydrogène entre les deux brins d'ADN se poursuit et, par conséquent, nous obtenons deux molécules à une seule chaîne.

2. Recuit des amorces. À une température de 50 à 60 degrés Celsius, les amorces sont attachées aux extrémités des molécules d'acide nucléique monocaténaires par le type de complémentarité.

3. Elongation. À une température de 72 degrés, se produit la synthèse de molécules bicaténaires filles d'acide désoxyribonucléique.

Séquençage de l'ADN

Les méthodes biologiques moléculaires nécessitent souvent une connaissance de la séquence de nucléotides dans une molécule d'acide désoxyribonucléique. Le séquençage est utilisé pour déterminer le code génétique . Les diagnostics moléculaires du futur seront basés sur les connaissances obtenues pour déterminer la séquence d'une personne.

Les différents types de séquençage suivants se distinguent:

• Séquençage par Maxam-Gilbert;
• Séquençage par Sanger;
• Pyrosequencing;
• Nanoporous séquençage.