La microscopie à fluorescence: principes de la méthode

L'absorption et la ré-émission de la lumière d'autres fluides inorganiques et organiques est le résultat de phosphorescence ou de fluorescence. La différence entre le phénomène est la durée de l'intervalle entre l'absorption et l'émission de flux lumineux. Lorsque la fluorescence de ces processus se produisent presque simultanément, tandis que la phosphorescence – avec un certain retard.

informations historiques

En 1852, le scientifique britannique Stokes, d'abord décrit la fluorescence. Il a introduit un nouveau terme à la suite des expériences avec la fluorine, qui émettent de la lumière rouge sous la lumière ultraviolette. Stokes a noté un phénomène intéressant. On constate que la longueur d'onde du rayonnement fluorescent est toujours plus grande que l'écoulement de la lumière d'excitation.

Pour confirmer l'hypothèse au 19ème siècle, il y a eu de nombreuses expériences. Ils ont montré qu'une variété d'échantillons fluoresce sous l'influence de la lumière ultraviolette. Parmi les matériaux, entre autres, été des cristaux, des résines, des minéraux, de la chlorophylle, des médicaments bruts, des composés inorganiques, des vitamines, des huiles. L'utilisation directe de colorants pour les tests biologiques ont commencé seulement en 1930

La microscopie à fluorescence: Description

Certains des matériaux utilisés dans la première moitié des études du 20e siècle présentaient une spécificité élevée. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Merci à la performance, qui ne peut être réalisée par des méthodes contrastées, la méthode de microscopie à fluorescence est devenu un outil essentiel dans la recherche biomédicale et biologique. De même des résultats importants ont été obtenus, et pour les matériaux.

? Quels sont les avantages de la méthode de microscopie par fluorescence? L'utilisation de nouveaux matériaux est devenu possible et la sélection des composants submicroscopiques de cellules très spécifiques. La microscopie à fluorescence peut détecter des molécules simples. Une variété de colorants permettent d'identifier plusieurs éléments à la fois. En dépit de la résolution spatiale limitée de la limite de diffraction de l'équipement, qui, à son tour, dépend des propriétés spécifiques de l'échantillon, l'identification des molécules en dessous de ce niveau est également tout à fait possible. Divers échantillons après irradiation exposition autofluorescence. Ce phénomène est largement utilisé dans la pétrologie, la botanique, l'industrie des semi-conducteurs.

traits

Étudier les tissus animaux ou pathogènes souvent compliqués ou trop faibles ou très fortes autofluorescence non spécifique. Toutefois, la valeur dans les études acquiert introduction dans les composants du matériau excité à une longueur d'onde spécifique et émettant l'intensité du flux de lumière nécessaire. Fluorochromes agissent comme des colorants capables d'indépendamment attachés aux structures (visible ou invisible). Ainsi, ils ont une sélectivité élevée à la cible, et le rendement quantique.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. La microscopie à fluorescence a été largement utilisé depuis l'avènement des colorants naturels et synthétiques. Ils possédaient certains profils d'intensité de l'émission et l'excitation et ciblées sur des cibles biologiques spécifiques.

Identification de molécules individuelles

Souvent, dans des conditions idéales, vous pouvez enregistrer une lueur d'élément distinct. Pour cela, entre autres, il est nécessaire de prévoir un bruit suffisamment faible du détecteur et l'arrière-plan optique. molécule à l'échec en raison Fluorescéine de photoblanchiment peut émettre jusqu'à 300 mille. Photons. A l'efficacité de la collecte de 20% du processus et peut les enregistrer en une quantité d'environ 60 mille.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. La microscopie à fluorescence basée sur photodiodes avalanche ou la multiplication électronique, a permis aux chercheurs d'observer le comportement des molécules individuelles à travers la seconde, et même dans certains cas minutes.

complexité

Une question clé en faveur de la suppression de fond optique de bruit. En raison du fait que la plupart des matériaux utilisés dans la conception de filtres et de lentilles présentent une certaine autofluorescence, les efforts des scientifiques dans les premières étapes ont été orientés à la production de composants ayant une faible fluorescence. Cependant, les expériences ultérieures ont conduit à de nouvelles conclusions. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. En particulier, on a constaté que la microscopie à fluorescence, basée sur une réflexion interne totale, il permet d'atteindre un faible bruit de fond et lumière de haute excitation d'intensité.

mécanisme

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Les principes de la microscopie par fluorescence, basé sur la réflexion interne totale est l'utilisation des ondes évanescentes ou évanescente. Il se produit à la frontière entre les médias avec différents indices de réfraction. Dans ce cas, le faisceau de lumière passe à travers le prisme. Il a un paramètre d'indice de réfraction élevé.

Le prisme adjacent à la solution aqueuse ou en verre avec le paramètre faible. Si un faisceau de lumière dirigée vers lui à un angle qui est plus important, le faisceau est totalement réfléchie à partir de l'interface. Ce phénomène, à son tour, provoque des ondes nonpropagating. En d'autres termes, le champ électromagnétique généré qui pénètre dans un milieu ayant un paramètre d'indice de réfraction inférieur à une distance inférieure à 200 nanomètres.

L'onde évanescente intensité de la lumière serait suffisante pour exciter les fluorophores. Cependant, en raison de sa profondeur extrêmement faible, son volume est très faible. Le résultat est un fond de bas niveau.

modification

La microscopie à fluorescence est basé sur la réflexion interne totale, peut être mis en œuvre avec epi-éclairage. Cela nécessite des lentilles avec une grande ouverture numérique (au moins 1,4, mais il est souhaitable qu'elle atteint 1,45 à 1,6), et partiellement éclairé appareil de terrain. Ce dernier est atteint avec une petite taille du spot. Pour une plus grande uniformité au moyen d'un anneau mince, qui est bloqué par une partie du courant. Pour l'angle critique, après quoi il y a une réflexion totale, nous avons besoin d'un haut niveau de réfraction du milieu d'immersion dans la lentille et le verre de couverture du microscope.